Toledo 人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞

細胞介紹

Toledo是1990年從患有彌漫性大細胞淋巴瘤(非霍奇金B細胞)的成年白人女性患者的外周血中分離的B淋巴細胞系。經過大劑量化liao和骨髓移植后，患者隨后出現腦部淋巴瘤。盡管細胞的形態類似于伯基特淋巴瘤，但細胞缺乏伯基特淋巴瘤的典型染色體易位。核型確實表現出多種染色體畸變。細胞不表達表面或細胞質免疫球蛋白。這些細胞對 Epstein-Barr 病毒呈陰性。

細胞特性

1） 來源：成年白人女性 外周血中分離的B淋巴細胞

2） 形態：淋巴母細胞樣  懸浮生長

3） 含量：>1x106 細胞數

4） 規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5）用途：僅供科研使用。

運輸和保存

干冰運輸及復蘇好存活細胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。

（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理

1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態的依據。

3）貼壁細胞：細胞在37℃培養箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養瓶中灌液培養基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養瓶中）,加入新配制的完quan培養基6-8mL，放到細胞培養箱中繼續培養。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

4）備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的完quan培養基來培養細胞。  收到細胞后一次傳代建議T25培養瓶1：2傳代 。

Toledo 人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞

一．培養基及培養凍存條件準備

1） 準備RPMI-1640（推薦iCell-0002）培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

注意：用推薦的wan全培養基重懸細胞沉淀，并分配到T25培養瓶中。在細胞回收過程中避免培養基堿度過高非常重要。建議在添加小瓶內容物之前，將含有wan全生長培養基的培養容器放入培養箱中至少 15 分鐘，以使培養基達到正常 pH 值（7.0 至 7.6）。

2）培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

二．細胞處理：

1） 凍存細胞的復蘇：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完quan培養基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完quan培養基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完quan培養基的培養瓶（或皿）中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白mei-0.53 mM EDTA于培養瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養箱中消化直至細胞層分散（通常在 5 至 15 分鐘內）以使培養基達到正常 pH 值（7.0 至 7.6），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，為避免結塊，在等待細胞分離時請勿敲擊或搖動燒瓶來攪動細胞。難以分離的細胞可置于37°C以利于分散。若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的wan全培養基以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）細胞凍存: 收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。

下面T25瓶為例；

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×107個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×10^6~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。